アクリジンオレンジ超生体染色法

アクリジンオレンジ超生体染色法

アクリジンオレンジチョウセイタイセンショクホウ

【英】acridine orange supravital staining

【独】Akridinorange Supravitalfa¨rbung

アクリジンオレンジは赤橙色の色素で，塩基性蛍光色素である．その水溶液は濃度によっていろいろな吸収スペクトルの違いを呈し，そのことを利用して細胞の種々の要素を緑・黄・赤橙などに染め分けて鏡検できるという利点をもっている．方法は500倍から10,000倍くらいのアクリジンオレンジ純アルコール溶液を作製し，スライド上にうすく塗布し，この上に血液の小滴をカバーグラスにとって封じ鏡検する．〔所見〕 顆粒がもっとも強く染まり赤橙色の蛍光を発し，微細なものまできわめて鮮明に見える．各種特殊顆粒，アズール顆粒，アウエル小体および中性赤空胞に相当するものはいずれもよく見られるが，ミトコンドリアは見られない．核は黄緑色の蛍光を発し，ギムザによる核構造物と同じようなものが見える．好中球・リンパ球の核は黄色．単球，好塩基球の核はそれより弱く緑黄色に光る．前赤芽球，骨髄芽球，吉田肉腫　，腹水肝癌（AH 130）などの細胞では核小体が黄緑色に鮮明に認められる．細胞質は好塩基性の強さに比例して強く染まり，種々の明るさの緑色蛍光を示す．細胞質は好塩基性の程度に応じてリンパ球では中等度の緑色蛍光　，単球ではそれより弱い，顆粒球はもっとも弱い程度を示す．形質細胞は黄緑色に光り，好塩基性の強い異型リンパ球では橙色光を帯びている．赤血球はヘモグロビンのため暗く見えるが，網状球の網状物質はきわめて明瞭に観察される．

アクリジンオレンジ超生体染色法

アクリジンオレンジ超生体染色法は、生体組織や採取直後の細胞を活性を損なわずに蛍光染色し、核酸含有量や細胞周期状態を迅速に可視化・定量できる方法です。アクリジンオレンジ（AO）は細胞膜を透過してDNAに結合すると緑色蛍光、RNAや一本鎖DNAに結合すると赤色蛍光を発し、生体内での細胞動態観察や微生物のVBNC検出にも応用されます。

1. 原理

• AOは塩基性アザ染料で、二重らせん構造のDNAに選択的に挿入結合し、励起波長502 nmで緑色蛍光を発します。
• 一本鎖DNAやRNAに結合すると励起460 nmで赤色蛍光を示し、染色後すみやかに観察すれば生体組織の核酸分布や細胞周期を評価できます。
• 細胞膜透過性が高いため、生細胞を固定せずにそのまま蛍光顕微鏡下で観察可能です。

2. 試薬・機器

以下は代表的な装置・試薬例です。用途や試料に応じて調整します。

3. 実験手順

1. 生体試料調製

• 微生物・血液細胞なら薄層スライド標本を作製し、風乾。
• 組織なら凍結薄切片をPBSで緩衝洗浄。

1. 染色

1. 染色バッファーをスライドに滴下し、室温で2 分間インキュベート。
2. 染液を除去し、蒸留水またはPBSで軽く洗浄後、空気乾燥。

2. 観察

• FITCフィルター（励起502 nm/蛍光525 nm）でDNA核を緑色、
• TRITCフィルター（励起460 nm/蛍光650 nm）でRNA/一本鎖DNAを赤色に観察。

3. 定量化（オプション）

• 顕微鏡下で形態的に核酸含量を分類・カウント。
• フローサイトメトリーと組み合わせた多重解析も可能。

4. 代表的な応用例

• 骨髄小核試験：Phenacetin投与ラットの骨髄細胞で、網赤血球タイプII/IIIのMNRETを高感度に検出。
• 微生物VBNC検出：海洋／環境試料中のViable But Non-Culturable細胞数を直接蛍光計数。
• 細胞死・アポトーシス解析：生細胞／死細胞の核の透過性変化をリアルタイムモニタリング。

5. 注意点と改善ポイント

• AOは強い変異原性を持つため、手袋・防護具の着用と吸引防止が必須です。
• 染色時間や緩衝液pH、AO濃度が観察感度に直結するため、事前に最適条件を小スケールで検討してください。
• 組織像観察では、背景蛍光を低減するためにホリデー固定や抗原賦活化処理との組み合わせも有効です。

さらに、青色励起と赤色蛍光の二重観察を活かし、マルチプレックス抗体染色やライブイメージング用蛍光プローブとの併用が広がっています。将来的には、超解像顕微鏡や光シート顕微鏡を用いたin vivoタイムラプス解析への展開も期待されます。

アクリジンオレンジの主な用途

アクリジンオレンジは塩基性アザ染料で、二重らせん構造のDNAに結合すると緑色蛍光、一本鎖DNAやRNAに結合すると赤色蛍光を示す蛍光核酸染色試薬です。そのスペクトル特性を活かし、細胞生物学から微生物検査、臨床診断、高度顕微鏡技術まで幅広く応用されています。

1. 細胞生物学

•          細胞周期解析（G0/G1、S、G2/M期のフローサイトメトリー判別）。

•          生死判定・アポトーシス検出（生細胞：緑、死細胞やアポトーシス細胞：赤の蛍光パターン）。

2. 微生物学

•          VBNC（Viable But Non-Culturable）細胞の直接蛍光計数（DEFT：直接蛍光濾紙法）。

•          AODC（Acridine Orange Direct Count）による土壌中微生物や飲料水中の菌数定量。

3. 遺伝毒性試験

•          骨髄小核試験における網赤血球および小核有核赤血球の高感度検出。

4. 臨床検査・寄生虫検出

•          髄液細胞診（細菌性・ウイルス性髄膜炎の細胞像解析）。

•          Trichomonas vaginalisなどの原虫を蛍光染色で迅速検出。

•          循環腫瘍細胞（CTC）の染色による希少細胞検出。

5. 高度顕微鏡・研究開発

•          多重蛍光抗体染色との併用による分子・構造の同時可視化。

•          光シート顕微鏡や超解像タイムラプス観察など、in vivoイメージングへの応用。

以上に加え、オートファジー研究での酸性オルガネラ可視化や、腫瘍細胞の薬剤応答モニタリングなど、専門的な領域への展開も進んでいます。

アクリジンオレンジの化学構造

アクリジンオレンジは、三環式のアクリジン骨格に3位および6位でジメチルアミノ基が導入された塩基性アザ染料です。環状π共役系と四つのメチル化アミノ基により、DNA二重鎖へのインターカレーションやRNAへの静電相互作用が可能となっています。

主要化学データ

分子構造の特徴

• アクリジンコア：ナフタレン様の二環芳香族＋中央にイミン状窒素をもつ三環系。
• 3位・6位ジアミノ置換：各窒素はエシュヴァイラー・クラルク（ホルムアルデヒド＋蟻酸）反応でメチル化され、四級アンモニウム前駆体となる。
• 正電荷性：塩酸塩として取り扱うことで、水溶液中で陽イオン性を示し、核酸の陰電荷に強く結合。
• 平面構造：ベンゼン環とアザ環が共面に近く、DNA二重らせんへのインターカレーションを促進。

合成の概要

1. 原料：3,6-アクリジンジアミン（acridine-3,6-diamine）
2. メチル化反応：ホルムアルデヒドと蟻酸を用いたエシュヴァイラー・クラルク法でアミノ基を四級化
3. 塩化処理：反応後に塩酸を添加し、HCl塩として単離・結晶化
4. 精製：再結晶またはクロマトグラフィーによる不純物除去で高純度化

光学的特性

• DNA結合時：最大励起502 nm、最大蛍光525 nm（緑）
• RNA結合時：最大励起460 nm、最大蛍光650 nm（赤）
• pH感受性：酸性条件下でプロトン化度が上がり、蛍光強度およびピーク波長が変化

今後は、この構造的特徴を利用して、蛍光寿命イメージング（FLIM）や二光子励起顕微鏡での応用が広がりつつあり、分子間相互作用の微細解析に貢献しています。

References
“アクリジンオレンジ,” Wikipedia, https://ja.wikipedia.org/wiki/アクリジンオレンジ.

アクリジンオレンジの他蛍光核酸染料との比較

アクリジンオレンジは細胞膜透過性が高く、二重螺旋DNA結合時に緑色蛍光（最大励起502 nm／発光525 nm）、一本鎖DNAやRNA結合時に赤色蛍光（最大励起460 nm／発光650 nm）を示す独特の二重蛍光スペクトルをもつ塩基性アザ染料です。

1. 生細胞染色 vs 固定染色

• アクリジンオレンジ

• 生細胞をそのまま蛍光顕微鏡下で観察可能
• 細胞周期やアポトーシスのリアルタイム解析に適す

• DAPI／Hoechst

• 紫外光励起（最大励起358 nm）で青色蛍光を発する
• 一部は生細胞にも透過するが，高エネルギー励起で細胞毒性の懸念

• Propidium iodide (PI)

• 細胞膜透過性を持たず，死細胞検出に限定
• 診断用途では生死判定プローブとして必須

2. 核酸区別能

アクリジンオレンジの最大の特長は，DNAとRNAを異なる蛍光色で区別できることです。一本鎖核酸結合時の赤色蛍光はリボソームやオルガネラの酸性環境可視化にも応用できます。
他染料はほぼDNA専用またはRNA非区別型であるため，同一試料中での両者同時計測は困難です。

3. 微生物計数・VBNC検出

アクリジンオレンジ直接計数（AODC）や直接蛍光濾紙法（DEFT）では，培養不能状態（VBNC）の微生物も赤色／緑色蛍光で即座に区別し定量できます。
SYBR GreenやEthidium bromideは主にDNA染色に特化し，VBNCのRNA活性評価には不向きです。

4. 操作性とコスト感

• 染色時間：数分のインキュベーションで完了
• 試薬コスト：比較的安価で市販品も豊富
• pH調整による感度調節も容易

対して，新世代の蛍光プローブ（例：SYTOシリーズ，PicoGreen）は特異性と高感度を誇る反面，試薬価格や専用フィルター要件が高くなりがちです。

5. 安全性と制限

• 変異原性の報告があり，取扱いは手袋・ドラフト必須
• 背景蛍光や酸性オルガネラの強調が過度になることも
• 超解像や二光子励起では蛍光寿命の短さが制約となる場合あり

特徴比較表

アクリジンオレンジは，生細胞染色・核酸二色区別・微生物VBNC検出・コスト効率のバランスに優れる一方，安全管理と撮影条件の最適化が必要です。今後は蛍光寿命イメージングや光シート顕微鏡との併用でさらに応用が拡大すると期待されます。